Optimasi Kondisi Reaksi untuk Mencapai Hasil Tinggi Stevia Rebaudioside D
Diet tinggi gula telah menyebabkan meningkatnya prevalensi berbagai penyakit kronis, termasuk obesitas, diabetes, penyakit kardiovaskular, dan hipertensi, yang menimbulkan kekhawatiran kesehatan masyarakat global yang signifikan. Stevia Rebaudioside D (Reb D), pemanis alami yang berasal dari tumbuhan, telah menarik perhatian besar sebagai pengganti gula karena kandungan nol kalori, kemanisan yang intens, dan profil rasa yang menyenangkan.
Namun, kehadirannya yang terbatas dalam stevia rebaudiana Bertoni dan tantangan terkait kelarutan rendah serta aktivitas enzimatik glikosiltransferase yang berasal dari tumbuhan telah menghambat aplikasi komersialnya yang luas. Sebagai respons terhadap masalah ini, ditemukan glikosiltransferase baru bernama YojK, yang berasal dari Bacillus subtilis 168. Studi ini memperkenalkan glikosiltransferase bakteri hasil rekayasa genetika, YojK-I241T/G327N, yang ditandai dengan kelarutan tinggi dan efisiensi katalitik, menawarkan potensi besar untuk produksi Reb D skala industri.
Pengembangan metode yang sangat efisien untuk produksi rebaudioside D menggunakan reaksi kaskade enzim YojK-I241T/G327N dan AtSuSy.
To address the issue of low solubility in plant-derived glycosyltransferases, researchers investigated the potential of using YojK, an O-glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168. YojK was chosen because of its demonstrated glycosylation activity with various substrates, including large molecules. After successful recombinant expression and purification, YojK was employed to glycosylate Reb A, resulting in the production of Stevia Reb D. Enzyme kinetic analysis revealed that YojK has lower catalytic activity toward Reb D compared to other glycosyltransferases. Consequently, the study suggests the necessity for structure-guided engineering to enhance YojK's catalytic activity for potential practical applications. (as shown in Gambar 1)
Gambar 1
Optimasi kondisi reaksi untuk mencapai hasil tinggi rebaudioside D.
The reaction conditions, including pH, temperature, and substrate concentration, can be optimized to achieve a high yield of Srevia Reb D. The study used molecular dynamics simulations to investigate how the YojK-I241T/G327N variant enhances Reb D glycosylation. The variant maintained a stable hydrogen bond between Reb A and H14 during simulations, unlike the wild-type(as shown in Gambar 2). This stability also extended to the distance between Reb A's O2 atom and UDPG's C1P. The YojK-I241T/G327N variant's improved catalytic efficiency was attributed to these stable interactions, suggesting its practical potential.
Gambar 2
Gambar 3
Kesimpulan
Pendekatan ini menghasilkan Reb D sebesar 83,47%. Secara khusus, penambahan 1 mM UDPG memungkinkan sintesis 20,59 g/L Reb D dengan hasil luar biasa 91,29%, melampaui studi sebelumnya. Proses ini menunjukkan potensi produksi Reb D skala industri, terutama setelah rekayasa struktural YojK.YojK dapat diekspresikan secara efisien dalam E. coli BL21 (DE3) dengan kelarutan tinggi. Melalui rekayasa berpemandu struktur, dibuat mutan ganda, YojK-I241T/G327N, yang memungkinkan produksi besar Reb D dengan hasil luar biasa sebesar 91,29% melalui daur ulang UDPG yang dikatalisis oleh sukrosa sintase AtSuSy. Studi ini menghadirkan YojK-I241T/G327N sebagai alat yang menjanjikan untuk produksi Reb D skala industri yang efektif secara ekonomi.
