Kuantifikasi NAD+ dan Metabolitnya di Saraf Skiatik Tikus
Pendahuluan
Peran penting nikotinamida adenin dinukleotida (NAD+) dan metabolitnya dalam penuaan dan neurodegenerasi telah diakui secara luas. Untuk mendorong kemajuan menuju penelitian biokimia dan intervensi yang menargetkan penyakit penuaan dan neurodegeneratif, sangat penting untuk mengukur secara akurat kadar NAD+ dan metabolitnya dalam jalur penyelamatan NAD+. Di sini, metode LC-MS/MS yang kuat dan akurat diterapkan untuk mengukur kadar NAD+ dan metabolitnya pada saraf sciatic tikus normal dan cedera.Keterbatasan metode yang ada untuk mengukur NAD+ dan metabolitnya
Metode tradisional untuk mengukur NAD+ dan metabolitnya, seperti HPLC-UV, NMR, elektroforesis kapiler zona, atau uji enzimatik kolorimetri, menghadapi berbagai tantangan dalam sensitivitas, selektivitas, dan pengukuran tidak langsung. Adapun uji LC-MS/MS yang ada untuk pengukuran NAD+ dan metabolitnya dalam sel atau jaringan, masih banyak kesulitan yang harus diatasi, seperti waktu analisis yang lama, perilaku retensi kromatografi yang buruk, dan bentuk puncak yang tidak memuaskan. Selain itu, hanya satu hingga tiga zat dalam jalur penyelamatan NAD+ yang dapat dicakup oleh metode ini.Modifikasi metode LC-MS/MS
Berdasarkan uji LC-MS/MS yang ada, modifikasi mengenai kondisi kromatografi, matriks pengganti, dan kondisi MS/MS dilakukan. Secara khusus, 5 μM asam metilen fosfonat digunakan sebagai aditif fase gerak, yang secara eksplisit meningkatkan intensitas sinyal dan bentuk puncak. Mengingat sifat sampel saraf yang relatif bersih dan sederhana serta ukurannya yang kecil, air ultrapure diuji sebagai matriks pengganti. Alih-alih kolom kromatografi interaksi hidrofilik dan kolom hypercarb, kolom Waters Atlantis Premier BEH C18 AX digunakan, yang teknologi permukaan kinerja tinggi MaxPeak HPS yang unik (mem passivasi dinding dalam kolom, menghilangkan permukaan logam) memungkinkan reproduktifitas tinggi, simetri puncak, dan pemisahan dasar semua analit.Selain itu, kondisi MS dioptimalkan untuk meminimalkan sinyal interferensi NAD+ di saluran adenosin difosfat ribosa siklik (cADPR) sambil mempertahankan respons cADPR dan nikotinamida mononukleotida (NMN), dengan 4000V untuk tegangan semprot ion, 450℃ untuk suhu pemanas turbo, 50 psi untuk Gas 1, 50 psi untuk Gas 2, 30 psi untuk gas kurtin, dan 12 psi untuk gas tumbukan.
Kromatogram representatif sampel saraf (normal vs cedera)
Semua lima analit mencapai pemisahan dasar, di mana cADPR adalah biomarker sensitif dalam model neurodegenerasi. Di sini, aksotomi saraf sciatic menginduksi degenerasi akson, menyebabkan penurunan kadar NAD+ dan peningkatan kadar NMN pada saraf yang cedera, menghasilkan peningkatan sekitar 2 kali lipat dalam rasio NMN/NAD+. Secara bersamaan, kadar nikotinamida (NAM) dan adenosin difosfat ribosa (ADPR) menurun sekitar 2 kali lipat, sementara kadar cADPR meningkat lebih dari 8 kali lipat. Hasil ini konsisten dengan penelitian yang dilaporkan sebelumnya, memverifikasi keakuratan metode LC-MS/MS yang dimodifikasi ini dalam mengukur NAD+ dan metabolitnya.
结论
Metode LC-MS/MS yang dimodifikasi ini memungkinkan pemisahan dasar yang efektif dari NAD+, NMN, NAM, ADPR, dan cADPR dalam waktu analisis singkat 5 menit, yang berkontribusi pada diagnosis dini berbagai gangguan neurologis dan pengembangan obat untuk penyakit penuaan dan neurodegeneratif.Referensi
Ma Y, Deng L, Du Z. Pengembangan dan validasi metode LC-MS/MS untuk mengukur NAD+ dan metabolit terkait pada saraf sciatic tikus dan penerapannya pada model hewan cedera saraf. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821NAD BONTAC
BONTACtelah berdedikasi pada R&D, manufaktur dan penjualan bahan baku untuk koenzim dan produk alami sejak 2012, dengan pabrik milik sendiri, lebih dari 170 paten global serta tim R&D yang kuat. BONTAC memiliki pengalaman R&D yang kaya dan teknologi canggih dalam biosintesisNAD dan prekursornya(misalnya NMN dan NR). Ada berbagai jenis NAD yang dapat dipilih, termasuk NAD ER Grade (penghilangan endotoksin), NAD Grade I (bubuk mentah IVD/suplemen makanan/kosmetik), NAD Grade II (API/intermediet) dan NAD Grade IV (jika ada persyaratan lebih tinggi pada kelarutan), yang dapat disediakan dalam bentuk bubuk beku-kering atau bubuk kristal. Kemurnian NAD BONTAC dapat mencapai di atas 98%.
