Kuantifikasi NAD+ dan Metabolitnya dalam Saraf Skiatik Tikus
Pendahuluan
Bagian penting dari nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) dan metabolitnya dalam penuaan serta neurodegenerasi telah diakui secara luas. Untuk mendorong kemajuan penelitian biokimia dan intervensi yang menargetkan penuaan dan penyakit neurodegeneratif, sangat penting untuk mengkuantifikasi NAD+ dan kadar metabolitnya secara akurat dalam jalur penyelamatan NAD+. Di sini, metode LC-MS/MS yang kuat dan akurat diterapkan untuk mengukur NAD+ dan kadar metabolitnya pada saraf skiatik tikus yang normal maupun yang cedera.Keterbatasan metode yang ada untuk mengkuantifikasi NAD+ dan metabolitnya
Metode tradisional untuk mengkuantifikasi NAD+ dan metabolitnya, seperti HPLC-UV, NMR, elektroforesis zona kapiler, atau uji enzimatik kolorimetrik, menghadapi berbagai tantangan dalam sensitivitas, selektivitas, dan pengukuran tidak langsung. Adapun uji LC-MS/MS yang sudah ada untuk NAD+ seluler atau jaringan dan pengukuran metabolitnya, masih banyak kesulitan yang harus diatasi, seperti waktu penggunaan yang lama, perilaku retensi kromatografi yang buruk, dan bentuk puncak yang tidak memuaskan. Selain itu, hanya satu hingga tiga zat dalam jalur penyelamatan NAD+ yang dapat dicakup oleh metode ini.Modifikasi metode LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Selain itu, kondisi MS dioptimalkan untuk meminimalkan sinyal interferensi NAD+ pada saluran siklik adenosine difosfat ribosa (cADPR) sambil mempertahankan respons cADPR dan nikotinamida mononukleotida (NMN), dengan 4000V untuk tegangan semprotan ion, 450°C untuk suhu pemanas turbo, 50 psi untuk Gas 1, 50 psi untuk Gas 2, 30 psi untuk gas tirai, dan 12 psi untuk gas tabrakan.
Kromatogram representatif sampel saraf (normal vs cedera)
Kelima analit tersebut mencapai pemisahan dasar, di mana cADPR adalah biomarker sensitif dalam model neurodegenerasi. Dalam hal ini, akkotomi saraf skiatik menyebabkan degenerasi aksonal, yang menyebabkan penurunan kadar NAD+ dan peningkatan kadar NMN pada saraf yang cedera, sehingga meningkatkan rasio NMN/NAD+ sekitar dua kali lipat. Secara bersamaan, kadar nikotinamida (NAM) dan adenosin difosfat ribose (ADPR) menurun sekitar 2 kali lipat, sementara kadar cADPR meningkat lebih dari 8 kali lipat. Hasil ini konsisten dengan penelitian yang telah dilaporkan sebelumnya, memverifikasi akurasi metode LS-MS/MS yang dimodifikasi ini dalam mengkuantifikasi NAD+ dan metabolitnya.
Kesimpulan
Metode LC-MS/MS yang dimodifikasi ini memungkinkan pemisahan dasar yang efektif antara NAD+, NMN, NAM, ADPR, dan cADPR dalam waktu singkat 5 menit, yang berkontribusi pada diagnosis dini berbagai gangguan neurologis dan pengembangan obat untuk penuaan dan penyakit neurodegeneratif.Referensi
Ma Y, Deng L, Du Z. Pengembangan dan validasi metode LC-MS/MS untuk mengkuantifikasi NAD+ dan metabolit terkait pada saraf sciatic tikus dan penerapannya pada model hewan cedera saraf. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC telah berdedikasi untuk R&D, manufaktur, dan penjualan bahan baku untuk koenzim dan produk alami sejak 2012, dengan pabrik milik sendiri, lebih dari 170 paten global, serta tim R&D yang kuat. BONTAC memiliki pengalaman R&D yang kaya dan teknologi canggih dalam biosintesis NAD dan pendahulunya (misalnya. NMN dan NR). Ada berbagai jenis NAD yang harus dipilih, meliputi NAD ER Grade (pengangkatan endoxin), NAD Grade I (IVD/suplemen makanan/bubuk mentah kosmetik), NAD Grade II (API/intermediate), dan NAD Grade IV (jika ada persyaratan kelarutan yang lebih tinggi), yang dapat disediakan dalam bentuk bubuk liofilisasi atau bubuk kristalin. Kemurnian BONTAC NAD dapat mencapai lebih dari 98%.
