Rekayasa enzim yang terhubung dengan pertumbuhan melalui manipulasi regenerasi kofaktor redoks

Semakin beragam bahan kimia kini diproduksi dari bahan baku terbarukan melalui cara bioteknologi. Bioproses sangat bergantung pada katalisis enzimatik untuk produksi senyawa ini secara efisien. Memastikan bahwa enzim bekerja optimal di lingkungan yang dibutuhkan sangat penting untuk produksi berkelanjutan.

Sifat seperti spesifisitas substrat, laju katalitik, dan stabilitas (termo)adalah beberapa faktor penting yang harus dioptimalkan untuk proses biologi yang efisien yang digerakkan oleh enzim. Optimasi ini bisa memakan waktu, mahal, dan menantang, sehingga cara yang efektif dan efisien biaya kemungkinan untuk seleksi berbasis pertumbuhan, enzim rekayasa dengan karakteristik yang diinginkan sangat dicari.

Keuntungan menggunakan seleksi berpasangan pertumbuhan sebagai bentuk seleksi enzim, yang melibatkan penghubungan aktivitas enzim dengan pertumbuhan sel. Metode ini dapat digunakan sebagai strategi seleksi throughput tinggi, dan dapat dicapai dengan memastikan pertumbuhan bergantung pada sintesis produk oleh enzim target atau dengan menghubungkan aktivitas enzim ke keadaan energi global sel. Biologi sintetis dapat digunakan untuk merekayasa strain yang cocok untuk seleksi growth-coupled, dan kemajuan terbaru berfokus pada rekayasa strain yang kekurangan dalam keadaan teroksidasi atau reduksi pasangan kofaktor redoks, yang dapat berfungsi sebagai platform rekayasa enzim. Penggunaan platform ini dapat mempercepat pengembangan biokatalis dan bioproses yang lebih baik.

Manfaat coupling pertumbuhan melalui kofaktor auxotrophy

Manfaat menggunakan kofaktor auxotrophy sebagai metode seleksi untuk merekayasa enzim yang terlibat dalam biosintesis bahan kimia tertentu, seperti lipid, biofuel, gas, pelarut organik, atau senyawa polimer. Pendekatan ini menawarkan beberapa manfaat unik, termasuk kemampuan untuk memilih produk yang diinginkan secara independen dari substrat atau produk yang diminati, memudahkan deteksi peningkatan aktivitas enzimatik, dan memberikan pembacaan untuk mendeteksi peningkatan aktivitas enzimatik. Selain itu, penggunaan kofaktor auksofil sebagai platform kopling pertumbuhan sangat bermanfaat karena sifat kodoks redoks yang umum dalam metabolisme mikroba berarti strategi rekayasa dapat dipindahkan secara lateral ke mikroba lain yang diminati, dan enzim dapat direkayasa langsung dalam lingkungan inang mikroba yang diinginkan. (ditampilkan sebagai gambar 1)

Gambar 1: Perbandingan beberapa teknik skrining/seleksi yang banyak digunakan untuk rekayasa enzim

Mutan yang kekurangan oksidasi NADH

Oksidasi NADH pada E. coli dapat terjadi melalui dua jalur, tergantung pada ketersediaan oksigen. Dalam kondisi aerobik, NADH terutama dioksidasi melalui respirasi untuk menghasilkan ATP, sedangkan dalam kondisi anaerobik, NADH dapat dioksidasi melalui jalur fermentasi untuk menghasilkan laktat dan etanol. Strain mutan E. coli, yang tidak dapat menggunakan jalur fermentasi campuran untuk oksidasi NADH selama pertumbuhan anaerobik, telah digunakan untuk mendorong jalur oksidasi NADH untuk sintesis anaerobik berbagai bahan kimia, seperti 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol, dan L-alanin. Strain mutan ini juga telah digunakan untuk merekayasa enzim dengan memanfaatkan prinsip redoks serupa, menghasilkan varian yang lebih baik. Strain yang dihasilkan dapat digunakan untuk merekayasa enzim dan jalur lain yang bergantung pada NAD(P)H.

Mutan yang kekurangan pengurangan NAD+  

Wenk et al. menciptakan strain E. coli dengan menghapus gen dihydrolipoyl dehydrogenase (lpd), yang mengakibatkan strain tersebut tidak dapat menghasilkan daya reduksi (NADH dan NADPH) dari metabolisme asetat karena tidak adanya aktivitas piruvat dehidrogenase. Hal ini menyebabkan strain tersebut menunjukkan auxotrophy untuk mengurangi daya saat ditanam secara aerobik di atas asetat sebagai satu-satunya sumber karbon. (ditampilkan sebagai gambar 2) Strain ini mampu tumbuh di atas asetat ketika dilengkapi dengan substrat glikolitik atas atau saat mengekspresikan dehidrogenase formate, etanol, atau metanol yang bergantung pada NAD+ dengan substrat masing-masing. Strain ini tidak digunakan untuk rekayasa enzim dan hanya dinilai untuk redoks kofaktor auxotrophy.
 

Gambar 2: Metabolisme Sentral 

Mutan yang kekurangan oksidasi NADPH

Ada dua strategi berbeda untuk menginduksi NADP+ auxotropi pada E. coli, dengan mengandalkan rekayasa jalur glikolitik untuk menghasilkan NADPH secara berlebihan. Strategi pertama melibatkan penghapusan gen gapA asli dan mengekspresikan enzim GAPDH yang heterologus bergantung pada NADP+, sementara strategi kedua melibatkan pengalihan fluks karbon melalui jalur pentosa fosfat. Strain yang dihasilkan tidak dapat tumbuh pada glukosa tetapi menunjukkan pertumbuhan dalam kondisi yang berbeda, dengan strain pertama tumbuh dalam kondisi anaerobik dan strain kedua dalam kondisi aerobik dengan gliserol sebagai substrat. Strain ini digunakan untuk merekayasa enzim dengan sifat yang lebih baik, termasuk spesifisitas substrat, aktivitas katalitik, dan termostabilitas.

Mutan yang kekurangan reduksi NADP+

Tiga bakteri berbeda, E. coli, P. putida, dan C. glutamicum, telah direkayasa menjadi NADPH-auxotroph, artinya mereka membutuhkan NADPH eksogen untuk pertumbuhan. Dalam kasus E. coli dan C. glutamicum, enzim metabolik sentral dihentikan untuk menghindari reduksi NADP+ ketika glukosa disediakan sebagai sumber karbon, sementara pada P. putida, rekayasa berbantuan CRISPR/nCas9 digunakan untuk mengganggu rangkaian gen target secara berurutan guna memahami keterlibatannya dalam metabolisme redoks. Strain NADPH-auxotroph kemudian digunakan untuk rekayasa enzim berpasangan pertumbuhan berdasarkan spesifisitas kofaktor. Satu putaran mutagenesis menggunakan E. coli menghasilkan dehidrogenase formate yang paling efisien dan spesifik yang bergantung pada NADP+ hingga saat ini, sementara P. putida dan C. glutamicum merupakan strain pertama dari spesies mereka yang dapat digunakan untuk jenis rekayasa ini.

Mutan yang kekurangan reduksi NMN+

Sistem seleksi yang dipadukan pertumbuhan dikembangkan untuk menghubungkan siklus kofaktor dan pertumbuhan berdasarkan kekurangan pengurangan NMN+. Strain E. coli SHuffle digunakan, yang membawa delesi pada dua gen yang terlibat dalam produksi glutathione yang berkurang. Glutathione reduktase yang bergantung pada NMNH dikembangkan melalui mutagenesis rasional untuk menghubungkan proses ini dengan siklus NMN+/NMNH, dan glukosa dehidrogenase yang bergantung pada NMN+ digunakan untuk mendukung siklus kofaktor NMN+/NMNH dan dengan demikian pertumbuhan. Studi ini juga menerapkan redoks kofaktor auxotrophy non-kanonik untuk rekayasa enzim yang berpasangan pertumbuhan untuk pertama kalinya, menghasilkan varian fosfit dehidrogenase yang stabil secara termotabel dengan efisiensi katalitik dan stabilitas temporal in vitro yang lebih baik. Pekerjaan ini memberikan regangan yang berguna untuk rekayasa enzim yang terhubung dengan pertumbuhan, bergantung pada siklus NMN+/NMNH dan auxotrofik untuk keadaan reduksi dari kofaktor redoks non-kanonik.

Potensi growth-coupling melalui kofaktor redoks berfungsi sebagai alat yang ampuh untuk merekayasa biokatalis, terutama dalam konteks bioproduksi berkelanjutan. Meskipun kemajuan yang signifikan telah dicapai dalam pembuatan strain redoks kofaktor auxotropik, pernyataan ini menunjukkan bahwa masih ada beberapa jalur penelitian yang belum dieksplorasi. Salah satunya melibatkan rekayasa strain kofaktor auxotrofik organisme selain E. coli, yang dapat membuka kemungkinan baru untuk rekayasa enzim yang terhubung dengan pertumbuhan.

Secara keseluruhan, laporan ini menunjukkan bahwa penggunaan growth-coupling berbasis kofaktor redoks merupakan peluang besar untuk rekayasa biokatalisis, khususnya untuk produksi produk yang tidak dapat memenuhi persyaratan pendekatan rekayasa enzim throughput tinggi lainnya. Laporan ini menekankan perlunya mengembangkan biokatalis yang lebih serbaguna dan efisien untuk bioproduksi berkelanjutan serta menekankan pentingnya penelitian berkelanjutan di bidang ini.


Referensi: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Rekayasa enzim yang digandeng pertumbuhan melalui manipulasi regenerasi kofaktor redox, Biotechnology Advances, 2023.