通过操纵氧化还原辅因子再生的生长偶联酶工程

越来越多的化学品现在正通过生物技术手段从可再生原料中生产。生物过程在很大程度上依赖于酶催化来高效生产这些化合物。因此，确保酶在其所需环境中发挥最佳性能对于可持续生产具有重要意义。

底物特异性、催化速率和（热）稳定性等特性是高效酶驱动生物过程中必须优化的几个关键因素。这种优化可能耗时、昂贵且具有挑战性，因此，有效且经济高效的方法，例如用于生长偶联选择的酶工程方法，备受追捧。

使用生长偶联选择作为酶选择形式具有优势，这种方法将酶的活性与细胞的生长联系起来。该方法可用作高通量选择策略，可通过确保生长依赖于目标酶的产物合成，或将酶的活性与细胞的整体能量状态联系起来来实现。合成生物学可用于工程化适合生长偶联选择的菌株，近期的进展集中在工程化缺乏氧化型或还原型氧化还原辅因子对的菌株，这些菌株可作为酶工程平台。使用这些平台可能加速改进生物催化剂和生物过程的发展。

通过辅因子营养缺陷型进行生长偶联的益处

使用辅因子营养缺陷型作为选择方法，用于工程化参与某些化学品（如脂质、生物燃料、气体、有机溶剂或聚合物化合物）生物合成的酶。这种方法提供了几个独特的优势，包括能够独立于目标底物或产物来选择所需产物，使得更容易检测改进的酶活性，并提供检测改进酶活性的读数。此外，使用辅因子营养缺陷型作为生长偶联平台是有益的，因为氧化还原辅因子在微生物代谢中的普遍性意味着工程策略可以横向转移到其他感兴趣的微生物中，并且酶可以直接在所需微生物宿主的环境中工程化。（如图1所示）

图1：几种广泛使用的酶工程筛选/选择技术的比较

缺乏NADH氧化的突变体

在大肠杆菌中，NADH的氧化可以通过两条途径发生，取决于氧气的可用性。在有氧条件下，NADH主要通过呼吸作用氧化以产生ATP，而在无氧条件下，它可以通过发酵途径氧化产生乳酸和乙醇。无法在厌氧生长期间使用混合发酵途径进行NADH氧化的大肠杆菌突变菌株已被用于驱动NADH氧化途径，用于各种化学品的厌氧合成，如2-甲基丙-1-醇、2,3-丁二醇、1-丁醇和L-丙氨酸。这些突变菌株也已通过利用类似的氧化还原原理来工程化酶，从而产生改进的变体。所得菌株可用于工程化其他NAD(P)H依赖性酶和途径。

缺乏NAD+还原的突变体

Wenk等人通过删除二氢硫辛酰胺脱氢酶（lpd）基因创建了一种大肠杆菌菌株，由于缺乏丙酮酸脱氢酶活性，该菌株无法从乙酸代谢中产生还原力（NADH和NADPH）。这导致该菌株在以乙酸为唯一碳源的有氧生长中表现出对还原力的营养缺陷型。（如图2所示）当补充上部糖酵解底物或表达NAD+依赖的甲酸、乙醇或甲醇脱氢酶及其各自底物时，该菌株能够在乙酸上生长。该菌株未用于酶工程，仅评估了氧化还原辅因子营养缺陷型。

图2：中心代谢

缺乏NADPH氧化的突变体

有两种不同的策略可在大肠杆菌中诱导NADP+营养缺陷型，依赖于工程化糖酵解途径以过量产生NADPH。第一种策略涉及删除天然gapA基因并表达异源NADP+依赖的GAPDH酶，而第二种策略涉及将碳通量重定向通过磷酸戊糖途径。所得菌株无法在葡萄糖上生长，但在不同条件下表现出生长，第一种菌株在厌氧条件下生长，第二种菌株在有氧条件下以甘油为底物生长。这些菌株用于工程化具有改进特性（包括底物特异性、催化活性和热稳定性）的酶。

缺乏NADP+还原的突变体

三种不同的细菌，大肠杆菌、恶臭假单胞菌和谷氨酸棒杆菌，已被工程化为NADPH营养缺陷型，意味着它们需要外源NADPH才能生长。在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的情况下，敲除了中心代谢酶以避免在葡萄糖作为碳源时发生NADP+还原，而在恶臭假单胞菌中，使用CRISPR/nCas9辅助工程依次破坏目标基因组以了解它们在氧化还原代谢中的作用。然后，NADPH营养缺陷型菌株被用于基于辅因子特异性的生长偶联酶工程。使用大肠杆菌进行单轮诱变产生了迄今为止最高效和特异的NADP+依赖的甲酸脱氢酶，而恶臭假单胞菌和谷氨酸棒杆菌代表了其物种中首批可用于此类工程的菌株。

缺乏NMN+还原的突变体

开发了一种基于NMN+还原缺陷的生长偶联选择系统，用于连接辅因子循环与生长。研究使用了E. coli SHuffle菌株，该菌株携带两个参与还原型谷胱甘肽产生的基因的缺失。通过理性突变开发了一种依赖NMNH的谷胱甘肽还原酶，将该过程与NMN+/NMNH循环联系起来，并使用依赖NMN+的葡萄糖脱氢酶来支持NMN+/NMNH辅因子循环，从而支持生长。该研究还首次将非经典氧化还原辅因子营养缺陷型应用于生长偶联酶工程，产生了一种热稳定的亚磷酸脱氢酶变体，其催化效率和体外时间稳定性均得到提高。该工作为依赖NMN+/NMNH循环且对非经典氧化还原辅因子的还原态具有营养缺陷型的生长偶联酶工程提供了一种有用的菌株。

通过氧化还原辅因子实现生长偶联的潜力是工程化生物催化剂的有力工具，特别是在可持续生物生产的背景下。尽管在生成氧化还原辅因子营养缺陷型菌株方面已取得显著进展，但该陈述表明仍有若干未探索的研究途径。其中之一涉及工程化除E. coli以外的生物的辅因子营养缺陷型菌株，这可能为生长偶联酶工程开辟新的可能性。

总体而言，这表明基于氧化还原辅因子的生长偶联代表了工程化生物催化的重大机遇，特别是对于无法满足其他高通量酶工程方法要求的产品生产。它强调了开发更通用、更高效的生物催化剂以实现可持续生物生产的必要性，并突出了在该领域持续研究的重要性。


参考文献：Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a，通过操纵氧化还原辅因子再生的生长偶联酶工程，Biotechnology Advances，2023年。