Kuantifikasi NAD + dan Metabolitnya dalam Saraf Linu Skiatik Tikus
Perkenalan
Bagian-bagian penting dari nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) dan metabolitnya dalam penuaan dan neurodegenerasi telah diakui secara luas. Untuk memacu kemajuan menuju penelitian dan intervensi biokimia yang menargetkan penuaan dan penyakit neurodegeneratif, sangat penting untuk mengukur NAD + dan kadar metabolitnya secara akurat dalam jalur penyelamatan NAD +. Di sini, metode LC-MS/MS yang kuat dan akurat diterapkan untuk mengukur kadar NAD + dan metabolitnya pada saraf skiatik tikus yang normal dan terluka.
Keterbatasan metode yang ada untuk mengukur NAD + dan metabolitnya
Metode tradisional untuk mengukur NAD + dan metabolitnya, seperti HPLC-UV, NMR, elektroforesis zona kapiler, atau uji enzimatik kolorimetri, menghadapi berbagai tantangan dalam sensitivitas, selektivitas, dan pengukuran tidak langsung. Adapun uji LC-MS/MS yang ada untuk NAD seluler atau jaringan NAD + dan pengukuran metabolitnya, masih banyak kesulitan yang harus diatasi, seperti waktu pengoperasian yang lebih lama, perilaku retensi kromatografi yang buruk, dan bentuk puncak yang tidak memuaskan. Selain itu, hanya satu hingga tiga zat dalam jalur penyelamatan NAD + yang dapat dicakup oleh metode ini.
Modifikasi metode LC-MS/MS
Berdasarkan pengujian LC-MS/MS yang ada, modifikasi mengenai kondisi kromatografi, matriks pengganti dan kondisi MS/MS dilakukan. Secara khusus, 5 μM asam metilen fosfonat digunakan sebagai aditif fase bergerak, yang secara eksplisit mempromosikan intensitas sinyal dan bentuk puncak. Mengingat sifat sampel yang relatif bersih dan sederhana dan ukurannya yang kecil, air ultramurni diuji sebagai matriks pengganti. Alih-alih kolom kromatografi cair interaksi hidrofilik dan kolom hiperkarbohidrat, kolom Waters Atlantis Premier BEH C18 AX digunakan, yang teknologi permukaan berkinerja tinggi MaxPeak HPS yang unik (mengpasifkan dinding bagian dalam kolom, menghilangkan permukaan logam) memungkinkan reproduktifitas tinggi, simetri puncak, dan pemisahan dasar dari semua analit.Selain itu, kondisi MS dioptimalkan untuk meminimalkan sinyal interferensi NAD + di saluran siklik adenosin difosfat ribose (cADPR) sambil mempertahankan respons cADPR dan nikotinamida mononukleotida (NMN), dengan 4000V untuk tegangan semprotan ion, 450 °C untuk suhu pemanas turbo, 50 psi untuk Gas 1, 50 psi untuk Gas 2, 30 psi untuk gas tirai, dan 12 psi untuk gas tabrakan.
Kromatogram perwakilan sampel saraf (normal vs terluka)
Kelima analit mencapai pemisahan dasar, di mana cADPR adalah biomarker sensitif dalam model neurodegenerasi. Di sini, akotomi saraf skiatik menginduksi degenerasi aksonal, yang menyebabkan penurunan kadar NAD + dan peningkatan kadar NMN pada saraf yang cedera, menghasilkan peningkatan sekitar 2 kali lipat dalam rasio NMN/NAD +. Secara bersamaan, kadar nikotinamida (NAM) dan adenosin difosfat ribose (ADPR), menurun sekitar 2 kali lipat, sedangkan kadar cADPR meningkat lebih dari 8 kali lipat. Hasil ini konsisten dengan penelitian yang dilaporkan sebelumnya, memverifikasi keakuratan metode LS-MS/MS yang dimodifikasi ini dalam mengukur NAD + dan metabolitnya.
Kesimpulan
Metode LC-MS/MS yang dimodifikasi ini memungkinkan pemisahan dasar yang efektif dari NAD +, NMN, NAM, ADPR, dan cADPR dalam waktu singkat 5 menit, yang berkontribusi pada diagnosis dini berbagai gangguan neurologis dan pengembangan obat untuk penuaan dan penyakit neurodegeneratif.
Referensi
Ma Y, Deng L, Du Z. Pengembangan dan validasi metode LC-MS / MS untuk mengukur NAD + dan metabolit terkait pada saraf skiatik tikus dan penerapannya pada model hewan cedera saraf. J Chromatogr A. doi:10.1016 / j.chroma.2024.464821
BONTAC NAD
BONTAC telah didedikasikan untuk R&D, pembuatan dan penjualan bahan baku untuk koenzim dan produk alami sejak 2012, dengan pabrik milik sendiri, lebih dari 170 paten global serta tim R&D yang kuat. BONTAC memiliki pengalaman R&D yang kaya dan teknologi canggih dalam biosintesis NAD dan pendahulunya (mis. NMN dan NR). Ada berbagai jenis NAD yang akan dipilih, meliputi NAD ER Grade (penghapusan endoksin), NAD Grade I (IVD / suplemen makanan / bubuk mentah kosmetik), NAD Grade II (API / perantara) dan NAD Grade IV (jika ada persyaratan yang lebih tinggi pada kelarutan), yang dapat disediakan dalam bentuk bubuk liofilisasi atau bubuk kristal. Kemurnian BONTAC NAD bisa mencapai di atas 98%.
Sanggahan
Artikel ini didasarkan pada referensi dalam jurnal akademik. Informasi yang relevan disediakan hanya untuk tujuan berbagi dan pembelajaran, dan tidak mewakili tujuan saran medis apa pun. Jika ada pelanggaran, silakan hubungi penulis untuk penghapusan. Pandangan yang diungkapkan dalam artikel ini tidak mewakili posisi BONTAC. Dalam keadaan apa pun BONTAC tidak akan bertanggung jawab atau berkewajiban dengan cara apa pun atas klaim, kerusakan, kerugian, pengeluaran atau biaya apa pun yang diakibatkan atau timbul secara langsung atau tidak langsung dari ketergantungan Anda pada informasi dan materi di situs web ini.